Geny jądrowe eukariontów zawierają introny usuwane przez spliceosom, a zdecydowana większość z nich charakteryzuje się obecnością konserwowanych sekwencji złączy GT-AG. Konwencjonalne introny spliceosomalne występują także w genach jądrowych euglenin (Euglenida, Euglenozoa, Excavata), jednak nie jest to jedyny typ intronów w tej grupie. W genach jądrowych euglenin występują także introny niekonwencjonalne, które nie posiadają konserwowanych sekwencji złączy, tworzą za to stabilną strukturę drugorzędową zbliżającą końce intronów i egzony na poziomie RNA. Mechanizm wycinania tego typu intronów nie został dotąd poznany. Celem projektu jest dokładniejsze scharakteryzowanie intronów niekonwencjonalnych. Wstępne badania sugerują, że introny niekonwencjonalne nie są usuwane tak jak konwencjonalne w formie lariatu, ale jako cząsteczki liniowe lub koliste. Badania te wskazują także, że są one usuwane później niż introny konwencjonalne, co jest sprzeczne z danymi literaturowymi.
W celu weryfikacji wstępnych wyników wskazujących, że introny niekonwencjonalne są usuwane w formie liniowej lub kolistej zostanie przeprowadzona seria eksperymentów opierających się na trawieniach RNA egzo- i endonukleazami, elektroforezie RNA w żelach akrylamidowych, hybrydyzacji Northern z wykorzystaniem sond korespondujących do wybranych intronów. W celu weryfikacji danych sugerujących, że introny niekonwencjonalne są usuwane później niż konwencjonalne zostanie przeprowadzona analiza pośrednich produktów splicingu z wykorzystaniem odwrotnej transkrypcji, amplifikacji PCR, analizy produktów i sekwencjonowania. Przeprowadzona zostanie również próba określenia lokalizacji procesu splicingu niekonwencjonalnego w oparciu o analizę obecności wyciętych intronów w różnych frakcjach komórkowych oraz z wykorzystaniem metody FISH.
Introny niekonwencjonalne w genach jądrowych euglenin są jedynymi intronami, dla których mechanizm wycinania nie został dotąd poznany. Co więcej, występują one tylko w stosunkowo niewielkiej, dobrze wyodrębnionej grupie eukariontów. Dokładna charakterystyka tego typu intronów zbliży nas do odpowiedzi na takie pytania: (1) jaki jest mechanizm ich usuwania; (2) jaki był sens ich powstania; (3) jaki jest sens ich utrzymywania w genomach. Przeprowadzone badania poszerzą także znacząco naszą wiedzę na temat molekularnych mechanizmów dojrzewania mRNA, które często są odmienne w różnych grupach organizmów, a pozostają niezbadane ze względu na zainteresowanie badaczy jedynie konkretnymi gatunkami modelowymi o dobrze opracowanych schematach postępowania. Wyniki przeprowadzonych badań będą miały także znaczenie bardziej uniwersalne – poszerzą one naszą ogólną wiedzę na temat intronów i ich roli u organizmów eukariotycznych, która ciągle nie została jeszcze jednoznacznie zdefiniowana.
Konferencje
- Gumińska N., Komorowska M., Milanowski R. (2019). The physical form of released nonconventional introns in Euglena gracilis. The Seventh Polish Evolutionary Conference. 18-20 September, Gdańsk, Poland.
- Gumińska N., Płecha M., Zakryś B., Milanowski R. (2019). Splicing Pathway of Nuclear Transcripts in Euglena gracilis. 8th European Congress of Protistology – ISOP joint meeting. 28 July – 2 August, Rome, Italy.
- Gumińska N., Płecha M., Zakryś B., Milanowski R. (2018). Order of introns removal from transcripts of gapC and tubA genes of euglenids. The Sixth Polish Evolutionary Conference. 26-28 September, Warsaw, Poland.
- Gumińska N., Zakryś B., Milanowski R. (2017). The order of intron removal during splicing of α-tubulin (tubA) pre-mRNA in Euglena gracilis. 15th International Congress of Protistology, 30 July – 4 August, Prague, Czech Republic.
- Gumińska N., Zakryś B., Milanowski R. (2017). A novel type of intronic circRNA derived from nonconventional introns in nuclear genes of euglenids. The 22nd Annual Meeting of the RNA Society. 30 May – 3 June, Prague, Czech Republic.
Prace dyplomowe
- Natalia Gumińska (2020). Charakterystyka intronów niekonwencjonalnych u euglenin (Euglenida). Praca doktorska.
- Michalina Komorowska (2020). Analiza formy fizycznej wyciętych intronów niekonwencjonalnych występujących w genach gapC i tubB u E. gracilis. Praca magisterska na kierunku Biotechnologia.
- Katarzyna Kerner (2018). Porównanie kolejności usuwania intronów dwóch typów z transkryptu genu gapC u Euglena gracilis i Euglena agilis. Praca licencjacka na kierunku Biotechnologia.
- Daria Zganiacz (2017). Charakterystyka kolistych cząsteczek kwasów rybonukleinowych – występowanie, funkcje, metody badania. Praca licencjacka na kierunku Biotechnologia w ramach MISMaP (praca opublikowana w Postępach Biochemii).
Publikacje
Gumińska, Natalia; Zakryś, Bożena; Milanowski, Rafał
A New Type of Circular RNA derived from Nonconventional Introns in Nuclear Genes of Euglenids Journal Article
In: Journal of Molecular Biology, vol. 433, no. 3, pp. 166758, 2021.
@article{GUMINSKA2021166758,
title = {A New Type of Circular RNA derived from Nonconventional Introns in Nuclear Genes of Euglenids},
author = {Natalia Gumińska and Bożena Zakryś and Rafał Milanowski},
url = {https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022283620306835?via%3Dihub},
doi = {https://doi.org/10.1016/j.jmb.2020.166758},
year = {2021},
date = {2021-02-05},
journal = {Journal of Molecular Biology},
volume = {433},
number = {3},
pages = {166758},
abstract = {Nuclear protein-coding genes of euglenids (Discoba, Euglenozoa, Euglenida) contain conventional (spliceosomal) and nonconventional introns. The latter have been found only in euglenozoans. A unique feature of nonconventional introns is the ability to form a stable and slightly conserved RNA secondary structure bringing together intron ends and placing adjacent exons in proximity. To date, little is known about the mechanism of their excision (e.g. whether it involves the spliceosome or not). The tubA gene of Euglena gracilis harbors three conventional and three nonconventional introns. While the conventional introns are excised as lariats, nonconventional introns are present in the cell solely as circular RNAs with full-length ends. Based on this discovery as well as on previous observations indicating that nonconventional introns are observed frequently at unique positions of genes, we suggest that this new type of intronic circRNA might play a role in intron mobility.},
keywords = {},
pubstate = {published},
tppubtype = {article}
}
Nuclear protein-coding genes of euglenids (Discoba, Euglenozoa, Euglenida) contain conventional (spliceosomal) and nonconventional introns. The latter have been found only in euglenozoans. A unique feature of nonconventional introns is the ability to form a stable and slightly conserved RNA secondary structure bringing together intron ends and placing adjacent exons in proximity. To date, little is known about the mechanism of their excision (e.g. whether it involves the spliceosome or not). The tubA gene of Euglena gracilis harbors three conventional and three nonconventional introns. While the conventional introns are excised as lariats, nonconventional introns are present in the cell solely as circular RNAs with full-length ends. Based on this discovery as well as on previous observations indicating that nonconventional introns are observed frequently at unique positions of genes, we suggest that this new type of intronic circRNA might play a role in intron mobility.
Gumińska, Natalia; Płecha, Magdalena; Zakryś, Bożena; Milanowski, Rafał
Order of removal of conventional and nonconventional introns from nuclear transcripts of Euglena gracilis Journal Article
In: PLoS Genetics, vol. 14, no. 10, pp. e1007761, 2018, ISSN: 15537404.
@article{Guminska2018b,
title = {Order of removal of conventional and nonconventional introns from nuclear transcripts of Euglena gracilis},
author = {Natalia Gumińska and Magdalena Płecha and Bożena Zakryś and Rafał Milanowski},
doi = {10.1371/journal.pgen.1007761},
issn = {15537404},
year = {2018},
date = {2018-01-01},
journal = {PLoS Genetics},
volume = {14},
number = {10},
pages = {e1007761},
abstract = {Nuclear genes of euglenids and marine diplonemids harbor atypical, nonconventional introns which are not observed in the genomes of other eukaryotes. Nonconventional introns do not have the conserved borders characteristic for spliceosomal introns or the sequence complementary to U1 snRNA at the 5' end. They form a stable secondary structure bringing together both exon/intron junctions, nevertheless, this conformation does not resemble the form of self-splicing or tRNA introns. In the genes studied so far, frequent nonconventional introns insertions at new positions have been observed, whereas conventional introns have been either found at the conserved positions, or simply lost. In this work, we examined the order of intron removal from Euglena gracilis transcripts of the tubA and gapC genes, which contain two types of introns: nonconventional and spliceosomal. The relative order of intron excision was compared for pairs of introns belonging to different types. Furthermore, intermediate products of splicing were analyzed using the PacBio Next Generation Sequencing system. The analysis led to the main conclusion that nonconventional introns are removed in a rapid way but later than spliceosomal introns. Moreover, the observed accumulation of transcripts with conventional introns removed and nonconventional present may suggest the existence of a time gap between the two types of splicing.},
keywords = {},
pubstate = {published},
tppubtype = {article}
}
Nuclear genes of euglenids and marine diplonemids harbor atypical, nonconventional introns which are not observed in the genomes of other eukaryotes. Nonconventional introns do not have the conserved borders characteristic for spliceosomal introns or the sequence complementary to U1 snRNA at the 5' end. They form a stable secondary structure bringing together both exon/intron junctions, nevertheless, this conformation does not resemble the form of self-splicing or tRNA introns. In the genes studied so far, frequent nonconventional introns insertions at new positions have been observed, whereas conventional introns have been either found at the conserved positions, or simply lost. In this work, we examined the order of intron removal from Euglena gracilis transcripts of the tubA and gapC genes, which contain two types of introns: nonconventional and spliceosomal. The relative order of intron excision was compared for pairs of introns belonging to different types. Furthermore, intermediate products of splicing were analyzed using the PacBio Next Generation Sequencing system. The analysis led to the main conclusion that nonconventional introns are removed in a rapid way but later than spliceosomal introns. Moreover, the observed accumulation of transcripts with conventional introns removed and nonconventional present may suggest the existence of a time gap between the two types of splicing.
Zganiacz, Daria; Milanowski, Rafał
Charakterystyka kolistych cząsteczek kwasów rybonukleinowych (circRNA) Journal Article
In: Postepy biochemii, vol. 63, no. 3, pp. 221–232, 2017, ISSN: 0032-5422.
@article{Zganiacz2017,
title = {Charakterystyka kolistych cząsteczek kwasów rybonukleinowych (circRNA) },
author = {Daria Zganiacz and Rafał Milanowski},
url = {http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29294267
https://postepybiochemii.ptbioch.edu.pl/index.php/PB/article/view/77},
issn = {0032-5422},
year = {2017},
date = {2017-01-01},
journal = {Postepy biochemii},
volume = {63},
number = {3},
pages = {221--232},
abstract = {Kwasy rybonukleinowe wystcepujca w różnych formach, micedzy innymi w kolistej (circRNA). Forma kolista RNA jest znacznie bardziej rozpowszechniona niż pierwotnie scadzono. U wirusa HDV, wiroidów oraz wiroidopodobnych satelitarnych RNA pełni funkcjce genomu. Koliste RNA zaobserwowano w zwicazku z dojrzewaniem prekursorów rRNA i tRNA niektórych archeonów. Może wystcepować jako produkt końcowy (introny) lub stadium przejściowe. U archeonów odnotowano również formy koliste kilku snoRNA oraz innych RNA pełnicacych funkcje regulacyjne. Zauważono powstawanie circRNA w zwicazku z dojrzewaniem pre-mRNA zawierajcacych introny spliceosomalne, grupy I oraz grupy II. Zaobserwowane czcasteczki składały sice z sekwencji samych intronów, samych eksonów lub obu rodzajów na raz. Intronowe circRNA mogca być powicazane z mobilnościca tychże elementów genetycznych. Eksonowe (wystcepujca u eukariontów) czcesto sca tkankowo specyficzne lub charakterystyczne dla określonego etapu rozwoju organizmu; niektóre sca zdolne do modulacji działania miRNA. Przypuszcza sice też, że sca powicazane z kilkoma chorobami neurodegeneracyjnymi. Koliste RNA sca potencjalnie użyteczne terapeutycznie i w diagnostyce.},
keywords = {},
pubstate = {published},
tppubtype = {article}
}
Kwasy rybonukleinowe wystcepujca w różnych formach, micedzy innymi w kolistej (circRNA). Forma kolista RNA jest znacznie bardziej rozpowszechniona niż pierwotnie scadzono. U wirusa HDV, wiroidów oraz wiroidopodobnych satelitarnych RNA pełni funkcjce genomu. Koliste RNA zaobserwowano w zwicazku z dojrzewaniem prekursorów rRNA i tRNA niektórych archeonów. Może wystcepować jako produkt końcowy (introny) lub stadium przejściowe. U archeonów odnotowano również formy koliste kilku snoRNA oraz innych RNA pełnicacych funkcje regulacyjne. Zauważono powstawanie circRNA w zwicazku z dojrzewaniem pre-mRNA zawierajcacych introny spliceosomalne, grupy I oraz grupy II. Zaobserwowane czcasteczki składały sice z sekwencji samych intronów, samych eksonów lub obu rodzajów na raz. Intronowe circRNA mogca być powicazane z mobilnościca tychże elementów genetycznych. Eksonowe (wystcepujca u eukariontów) czcesto sca tkankowo specyficzne lub charakterystyczne dla określonego etapu rozwoju organizmu; niektóre sca zdolne do modulacji działania miRNA. Przypuszcza sice też, że sca powicazane z kilkoma chorobami neurodegeneracyjnymi. Koliste RNA sca potencjalnie użyteczne terapeutycznie i w diagnostyce.
