Jedną z niezwykłych cech genów jądrowych euglenin jest obecność w nich dwóch typów intronów: konwencjonalnych intronów spliceosomalnych o konserwowanych końcach GT/C-AG oraz nietypowych intronów niekonwencjonalnych. Introny niekonwencjonalne euglenin nie posiadają konserwowanych sekwencji złączy, tworzą za to stabilną strukturę drugorzędową, zbliżającą końce intronów i egzony na poziomie RNA. Introny konwencjonalne występują w pozycjach konserwowanych, podczas gdy introny niekonwencjonalne w pozycjach unikalnych dla pojedynczych szczepów, gatunków lub niewielkich grup gatunków blisko spokrewnionych ze sobą. Niektóre introny, nazywane pośrednimi posiadają cechy obu wspomnianych grup, dlatego uważa się, że mogą one być formami przejściowymi pomiędzy intronami konwencjonalnymi i niekonwencjonalnymi. Wiedza na temat nabywania nowych intronów niekonwencjonalnych oraz zmian typów jest ciągle niewielka i ogranicza się do danych dla pojedynczych genów. Najlepszym źródłem uzyskania pełniejszych danych na temat ewolucji intronów w genach jądrowych euglenin wydaje się być poznanie sekwencji genomów jądrowych różnych ich przedstawicieli. Podstawowym celem poniższego projektu jest poznanie sekwencji genomów jądrowych dwóch gatunków euglenin: E. hyemalis oraz E. longa. Na podstawie uzyskanych danych, a także na podstawie danych dla genomu E. gracilis przeprowadzone zostaną analizy rozmieszczenia intronów w homologicznych genach a także analizy sekwencji intronów różnych typów. Spodziewamy się, że na podstawie uzyskanych informacji uda nam się: (1) oszacować skalę procesów nabywania i tracenia intronów różnych typów, (2) oszacować liczbę nowych intronów niekonwencjonalnych nabytych po rozejściu się linii ewolucyjnych E. longa – E. hyemalis/E. gracilis oraz E. hyemalis – E. gracilis, (3) wskazać elementy najbardziej konserwowane w intronach niekonwencjonalnych, (4) wskazać elementy charakterystyczne dla sekwencji będących źródłem intronów i elementy wskazujących na mechanizm ich nabywania, (5) wskazać introny pośrednie, wycinane potencjalnie przez dwa mechanizmy, (6) wskazać introny dla których doszło do zmiany typu/mechanizmu wycinania.
Wyizolowany DNA będzie sekwencjonowany dwiema metodami nowej generacji: metodą Ilumina oraz metodą PacBio. Szacujemy, że połączenie tych dwóch metod umożliwi uzyskanie długich fragmentów genomu o jakości odpowiedniej do poszukiwania genów Dla uzyskanych sekwencji genomowych, a także dla sekwencji genomu E. gracilis przeprowadzone zostaną analizy porównawcze, mające na celu wskazanie starych i nowych intronów niekonwencjonalnych, intronów pośrednich oraz zmian typów intronów.
Spodziewane wyniki analiz genomowych pozwolą na globalne oszacowanie procesów nabywania i tracenia intronów w genach jądrowych euglenin. Liczymy również, że uda się wskazać różnice pomiędzy intronami starszymi ewolucyjnie, obecnymi u wszystkich analizowanych gatunków, a intronami młodszymi, wstawionymi do genów pojedynczych taksonów stosunkowo niedawno. Różnice takie ułatwiłyby wskazanie celu i sensu nabywania nowych sekwencji niekodujących w obrębie genów. Odpowiedzi na te pytania poszerzyłyby nie tylko naszą wiedzę na temat ewolucji genomów euglenin ale również na temat roli intronów różnych typów w genach jądrowych wszystkich eukariontów. Wydaje się bowiem, że pomimo wielu lat badań nie wszystkie funkcje intronów zostały poznane.
Konferencje
- Semik A., Hałakuc P., Mikina W., Milanowski R. (2022). Statistical machine learning aiding the recognition of noncanonical introns in three Euglena genomes. 41th Jirovec’s Protozoological Days by Czech Society for Parasitology, 21-24 June, Svratka, Czech Republic.
- Hałakuc P., Jagielska M., Płecha M., Maciszewski K., Zakryś B., Milanowski R., Karnkowska A. (2022). Structure and evolution of mitochondrial genomes in phototrophic Euglenids. 41th Jirovec’s Protozoological Days by Czech Society for Parasitology, 21-24 June, Svratka, Czech Republic.
- Jagielska M., Płecha M., Hałakuc P., Gumińska N., Karnkowska A., Zakryś B., Milanowski R. (2022). The analysis of whole genome assemblies (WGA) reveals a bizzare structure of euglenids mitochondrial genomes. 41th Jirovec’s Protozoological Days by Czech Society for Parasitology, 21-24 June, Svratka, Czech Republic.
- Mikina W., Hałakuc P. Milanowski R. (2021). Manual annotation as a key reference for automatic prediction of nonconventional introns. 1st Annual International Congress on Euglenoids. 8-11 November, Online.
- Hałakuc P., Semik A., Mikina W., Różycka J., Płecha M., Gumińska N., Karnkowska A., Milanowski R. (2021). Canonical and nonconventional introns in three new Euglena genomes. 1st Annual International Congress on Euglenoids. 8-11 November, Online.
- Płecha M., Hałakuc P., Jagielska M., Karnkowska A., Milanowski R. (2021). The analysis of whole genome assemblies (WGA) reveals a bizarre structure of euglenids mitochondrial genomes. 1st Annual International Congress on Euglenoids. 8-11 November, Online.
- Płecha M., Hałakuc P., Jagielska M., Karnkowska A., Milanowski R. (2021). Mitochondrial genomes of Euglena gracilis , E. hiemalis and E. longa obtained from the whole genome assemblies (WGA). EMBO Young Scientists Forum. 21-22 October, Warsaw, Poland.
- Hałakuc P., Płecha M., Różycka J., Milanowski R., Karnkowska A. (2020). Nonconventional genomics of Euglena species. (2020). 4th EMBO Workshop on Computational and Structural Biology and Chemistry; 28-29.02, Waplewo, Poland
- Hałakuc P., Gumińska N., Karnkowska A., Milanowski R. (2019) Exception within exceptions – unusual organization of rRNA genes in Euglena longa – poster, VIII European Congress of Protistology – ISOP joint meeting; 28 lipca – 2 sierpnia, Rzym, Włochy
- Hałakuc P., Karnkowska A., Milanowski R. (2018). Tracing evolutionary changes in rRNA genes in Euglenozoa. The Sixth Polish Evolutionary Conference. 26-28 September, Warsaw, Poland.
- Płecha M., Walkiewicz H., Gumińska N., Karnkowska A., Zakryś B., Milanowski R. (2018). Evolution of introns in the Euglena hiemalis genes based on the draft genome assembly analysis. The Sixth Polish Evolutionary Conference. 26-28 September, Warsaw, Poland.
- Płecha M., Walkiewicz H., Gumińska N., Karnkowska A., Zakryś B., Milanowski R. (2018). Annotation-directed draft genome of the non-model species Euglena hiemalis. XXII meeting of the International Society for Evolutionary Protistology, 27 May – 1 June, Droushia village, Cyprus.
- Hałakuc P., Karnkowska A., Milanowski R. (2018). Tracing evolutionary changes in rRNA genes in Euglenozoa. 48th Jirovec’s Protozoological Days by Czech Society for Parasitology, 1-4 May, Ostrava, Czech Republic.
- Walkiewicz H., Płecha M., Karnkowska A., Gawryluk R., Keeling P.J., Milanowski R. (2018). Characteristics of nonconventional introns in genomes of marine diplonemids. 48th Jirovec’s Protozoological Days by Czech Society for Parasitology, 1-4 May, Ostrava, Czech Republic.
- Wysocka-Korzun H., Płecha M., Karnkowska A., Gawryluk R., Keeling P.J., Milanowski R. (2017). Analysis of nonconventional introns in genomes of marine diplonemids. 15th International Congress of Protistology, 30 July – 4 August, Prague, Czech Republic.
- Płecha M., Wysocka-Korzun H., Gumińska N., Karnkowska A., Zakryś B., Milanowski R. (2017). Whole genome studies of two non-model species of euglenids: Euglena longa and E. hiemalis. 15th International Congress of Protistology, 30 July – 4 August, Prague, Czech Republic.
- Hałakuc P., Karnkowska A., Milanowski R. (2017). Evolution of ribosomal RNA genes in Euglenozoa. 15th International Congress of Protistology, 30 July – 4 August, Prague, Czech Republic.
Prace dyplomowe
- Weronika Mikina (2023). Analiza zdarzeń ewolucyjnych kształtujących strukturę genomów jądrowych euglenin na podstawie manualnej adnotacji wybranych genów. Praca magisterska na kierunku Biotechnologia.
- Maria Jagielska (2022). Analiza genomów mitochondrialnych wybranych gatunków euglenin. Praca magisterska na kierunku Biologia
- Anna Semik (2021). Analiza intronów niekonwencjonalnych w genach jądrowych euglenin. Praca licencjacka na kierunku Bioinformatyka i Biologia Systemów.
- Antonina Ignatenko (2019). Mechanizmy utraty i nabywania intronów spliceosomalnych w genach jądrowych eukariontów. Praca licencjacka na kierunku Biotechnologia (praca opublikowana w Postępach Biochemii).
- Paweł Hałakuc (2018). Tracing evolutionary changes in rRNA genes of Euglenozoa. Praca magisterska na kierunku Biotechnologia w ramach MISMaP.
Publikacje
Hałakuc, Paweł; Karnkowska, Anna; Milanowski, Rafał
Typical structure of rRNA coding genes in diplonemids points to two independent origins of the bizarre rDNA structures of euglenozoans Journal Article
In: BMC Ecology and Evolution, vol. 22, no. 1, pp. 59, 2022, ISSN: 2730-7182.
@article{Haakuc2022,
title = {Typical structure of rRNA coding genes in diplonemids points to two independent origins of the bizarre rDNA structures of euglenozoans},
author = {Paweł Hałakuc and Anna Karnkowska and Rafał Milanowski},
url = {https://doi.org/10.1186/s12862-022-02014-9
https://bmcevolbiol.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12862-022-02014-9},
doi = {10.1186/s12862-022-02014-9},
issn = {2730-7182},
year = {2022},
date = {2022-05-09},
journal = {BMC Ecology and Evolution},
volume = {22},
number = {1},
pages = {59},
abstract = {Members of Euglenozoa (Discoba) are known for unorthodox rDNA organization. In Euglenida rDNA is located on extrachromosomal circular DNA. In Kinetoplastea and Euglenida the core of the large ribosomal subunit, typically formed by the 28S rRNA, consists of several smaller rRNAs. They are the result of the presence of additional internal transcribed spacers (ITSs) in the rDNA. Diplonemea is the third of the main groups of Euglenozoa and its members are known to be among the most abundant and diverse protists in the oceans. Despite that, the rRNA of only one diplonemid species, Diplonema papillatum, has been examined so far and found to exhibit continuous 28S rRNA. Currently, the rDNA organization has not been researched for any diplonemid. Herein we investigate the structure of rRNA genes in classical (Diplonemidae) and deep-sea diplonemids (Eupelagonemidae), representing the majority of known diplonemid diversity. The results fill the gap in knowledge about diplonemid rDNA and allow better understanding of the evolution of the fragmented structure of the rDNA in Euglenozoa.},
keywords = {},
pubstate = {published},
tppubtype = {article}
}
Members of Euglenozoa (Discoba) are known for unorthodox rDNA organization. In Euglenida rDNA is located on extrachromosomal circular DNA. In Kinetoplastea and Euglenida the core of the large ribosomal subunit, typically formed by the 28S rRNA, consists of several smaller rRNAs. They are the result of the presence of additional internal transcribed spacers (ITSs) in the rDNA. Diplonemea is the third of the main groups of Euglenozoa and its members are known to be among the most abundant and diverse protists in the oceans. Despite that, the rRNA of only one diplonemid species, Diplonema papillatum, has been examined so far and found to exhibit continuous 28S rRNA. Currently, the rDNA organization has not been researched for any diplonemid. Herein we investigate the structure of rRNA genes in classical (Diplonemidae) and deep-sea diplonemids (Eupelagonemidae), representing the majority of known diplonemid diversity. The results fill the gap in knowledge about diplonemid rDNA and allow better understanding of the evolution of the fragmented structure of the rDNA in Euglenozoa.
Soukal, Petr; Hrdá, Štěpánka; Karnkowska, Anna; Milanowski, Rafał; Szabová, Jana; Hradilová, Miluše; Strnad, Hynek; Vlček, Čestmír; Čepička, Ivan; Hampl, Vladimír
Heterotrophic euglenid Rhabdomonas costata resembles its phototrophic relatives in many aspects of molecular and cell biology Journal Article
In: Scientific Reports, vol. 11, no. 1, pp. 13070, 2021, ISSN: 2045-2322.
@article{Soukal2021,
title = {Heterotrophic euglenid Rhabdomonas costata resembles its phototrophic relatives in many aspects of molecular and cell biology},
author = {Petr Soukal and Štěpánka Hrdá and Anna Karnkowska and Rafał Milanowski and Jana Szabová and Miluše Hradilová and Hynek Strnad and Čestmír Vlček and Ivan Čepička and Vladimír Hampl},
url = {https://doi.org/10.1038/s41598-021-92174-3
http://www.nature.com/articles/s41598-021-92174-3},
doi = {10.1038/s41598-021-92174-3},
issn = {2045-2322},
year = {2021},
date = {2021-12-01},
journal = {Scientific Reports},
volume = {11},
number = {1},
pages = {13070},
abstract = {Euglenids represent a group of protists with diverse modes of feeding. To date, only a partial genomic sequence of Euglena gracilis and transcriptomes of several phototrophic and secondarily osmotrophic species are available, while primarily heterotrophic euglenids are seriously undersampled. In this work, we begin to fill this gap by presenting genomic and transcriptomic drafts of a primary osmotroph, Rhabdomonas costata . The current genomic assembly length of 100 Mbp is 14× smaller than that of E. gracilis . Despite being too fragmented for comprehensive gene prediction it provided fragments of the mitochondrial genome and comparison of the transcriptomic and genomic data revealed features of its introns, including several candidates for nonconventional types. A set of 39,456 putative R. costata proteins was predicted from the transcriptome. Annotation of the mitochondrial core metabolism provides the first data on the facultatively anaerobic mitochondrion of R. costata , which in most respects resembles the mitochondrion of E. gracilis with a certain level of streamlining. R. costata can synthetise thiamine by enzymes of heterogenous provenances and haem by a mitochondrial-cytoplasmic C4 pathway with enzymes orthologous to those found in E. gracilis . The low percentage of green algae-affiliated genes supports the ancestrally osmotrophic status of this species.},
keywords = {},
pubstate = {published},
tppubtype = {article}
}
Euglenids represent a group of protists with diverse modes of feeding. To date, only a partial genomic sequence of Euglena gracilis and transcriptomes of several phototrophic and secondarily osmotrophic species are available, while primarily heterotrophic euglenids are seriously undersampled. In this work, we begin to fill this gap by presenting genomic and transcriptomic drafts of a primary osmotroph, Rhabdomonas costata . The current genomic assembly length of 100 Mbp is 14× smaller than that of E. gracilis . Despite being too fragmented for comprehensive gene prediction it provided fragments of the mitochondrial genome and comparison of the transcriptomic and genomic data revealed features of its introns, including several candidates for nonconventional types. A set of 39,456 putative R. costata proteins was predicted from the transcriptome. Annotation of the mitochondrial core metabolism provides the first data on the facultatively anaerobic mitochondrion of R. costata , which in most respects resembles the mitochondrion of E. gracilis with a certain level of streamlining. R. costata can synthetise thiamine by enzymes of heterogenous provenances and haem by a mitochondrial-cytoplasmic C4 pathway with enzymes orthologous to those found in E. gracilis . The low percentage of green algae-affiliated genes supports the ancestrally osmotrophic status of this species.
Ignatenko, Antonina; Gumińska, Natalia; Milanowski, Rafał
Mechanizmy utraty i nabywania intronów spliceosomalnych Journal Article
In: Postepy biochemii, vol. 65, no. 4, pp. 289–298, 2019, ISSN: 00325422.
@article{Ignatenko2019,
title = {Mechanizmy utraty i nabywania intronów spliceosomalnych},
author = {Antonina Ignatenko and Natalia Gumińska and Rafał Milanowski},
url = {https://postepybiochemii.ptbioch.edu.pl/index.php/PB/article/view/292},
doi = {10.18388/pb.2019_292},
issn = {00325422},
year = {2019},
date = {2019-01-01},
journal = {Postepy biochemii},
volume = {65},
number = {4},
pages = {289--298},
abstract = {Introny to wewnątrzgenowe sekwencje niekodujące. Dawniej były uznawane za „śmieciowy” DNA, jednak obecnie uważa się, że są ważnymi elementami wpływającymi na funkcjonowanie genomu. Udowodniono, że introny zwiększają różnorodność transkryptomu i proteomu, spełniają w komórce role regulatorowe, wpływają na ekspresję genów oraz obróbkę, translację i degradację mRNA. Ze względu na sposób powstawania dzielą się na trzy główne kategorie: spliceosomalne, samowycinające się oraz introny tRNA. Introny spliceosomalne są charakterystyczne dla organizmów eukariotycznych. Analizy sekwencji genów ortologicznych w rożnych grupach eukariontów pozwoliły zidentyfikować wiele przypadków nabywania oraz utraty intronów. Niektóre z tych zdarzeń miały miejsce w dalekiej przeszłości, do innych doszło stosunkowo niedawno. Uważa się, że procesy te mogą działać jako jedna z sił napędowych w ewolucji genów eukariotycznych.},
keywords = {},
pubstate = {published},
tppubtype = {article}
}
Introny to wewnątrzgenowe sekwencje niekodujące. Dawniej były uznawane za „śmieciowy” DNA, jednak obecnie uważa się, że są ważnymi elementami wpływającymi na funkcjonowanie genomu. Udowodniono, że introny zwiększają różnorodność transkryptomu i proteomu, spełniają w komórce role regulatorowe, wpływają na ekspresję genów oraz obróbkę, translację i degradację mRNA. Ze względu na sposób powstawania dzielą się na trzy główne kategorie: spliceosomalne, samowycinające się oraz introny tRNA. Introny spliceosomalne są charakterystyczne dla organizmów eukariotycznych. Analizy sekwencji genów ortologicznych w rożnych grupach eukariontów pozwoliły zidentyfikować wiele przypadków nabywania oraz utraty intronów. Niektóre z tych zdarzeń miały miejsce w dalekiej przeszłości, do innych doszło stosunkowo niedawno. Uważa się, że procesy te mogą działać jako jedna z sił napędowych w ewolucji genów eukariotycznych.
Gumińska, Natalia; Płecha, Magdalena; Walkiewicz, Halszka; Hałakuc, Paweł; Zakryś, Bożena; Milanowski, Rafał
Culture purification and DNA extraction procedures suitable for next-generation sequencing of euglenids Journal Article
In: Journal of Applied Phycology, vol. 30, no. 6, pp. 3541–3549, 2018, ISSN: 1573-5176.
@article{Guminska2018,
title = {Culture purification and DNA extraction procedures suitable for next-generation sequencing of euglenids},
author = {Natalia Gumińska and Magdalena Płecha and Halszka Walkiewicz and Paweł Hałakuc and Bożena Zakryś and Rafał Milanowski},
url = {https://doi.org/10.1007/s10811-018-1496-0},
doi = {10.1007/s10811-018-1496-0},
issn = {1573-5176},
year = {2018},
date = {2018-01-01},
journal = {Journal of Applied Phycology},
volume = {30},
number = {6},
pages = {3541--3549},
abstract = {In the present study, five different DNA extraction procedures were examined to determine their effectiveness for extracting DNA suitable for NGS applications. This included two silica-membrane spin column kits, phenol:chloroform, and two CTAB-based methods. Spectrophotometric and fluorimetric measurements as well as standard gel electrophoresis were used as criteria for evaluating the quantity and quality of the isolated DNA prior to the sequencing. Herein, the method of establishing and maintaining axenic Euglena cultures is also presented. The modified CTAB-based method proved to be highly efficient. In terms of DNA quantity and purity (according to the absorbance ratios), the chosen method resulted in DNA of high molecular weight and quality, which fulfills the library construction requirements. Genomic DNA of Euglena hiemalis (CCAP 1224/35) and E. longa (CCAP 1204-17a) isolated using the suggested protocol had been successfully sequenced on the Illumina HiSeq platform. A modified, rapid CTAB-based method of total DNA isolation from Euglena has been described. In terms of the DNA quantity and quality, the protocol devised involving the washing step with DMSO:acetonitrile proved superior to the commonly used, commercially manufactured kits and isolation with phenol:chloroform. The method is also less labor-intensive and time-consuming than the traditional CTAB-based protocol.},
keywords = {},
pubstate = {published},
tppubtype = {article}
}
In the present study, five different DNA extraction procedures were examined to determine their effectiveness for extracting DNA suitable for NGS applications. This included two silica-membrane spin column kits, phenol:chloroform, and two CTAB-based methods. Spectrophotometric and fluorimetric measurements as well as standard gel electrophoresis were used as criteria for evaluating the quantity and quality of the isolated DNA prior to the sequencing. Herein, the method of establishing and maintaining axenic Euglena cultures is also presented. The modified CTAB-based method proved to be highly efficient. In terms of DNA quantity and purity (according to the absorbance ratios), the chosen method resulted in DNA of high molecular weight and quality, which fulfills the library construction requirements. Genomic DNA of Euglena hiemalis (CCAP 1224/35) and E. longa (CCAP 1204-17a) isolated using the suggested protocol had been successfully sequenced on the Illumina HiSeq platform. A modified, rapid CTAB-based method of total DNA isolation from Euglena has been described. In terms of the DNA quantity and quality, the protocol devised involving the washing step with DMSO:acetonitrile proved superior to the commonly used, commercially manufactured kits and isolation with phenol:chloroform. The method is also less labor-intensive and time-consuming than the traditional CTAB-based protocol.
